CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU SƠ LỰC VỀ PHÒNG ĐÔNG Y THỰC NGHIỆM
* Cơ cấu, nhân sự
- Phòng được thành lập năm 1965
- Tổng số cán bộ: 12 người trong đó
có 4 thạc sĩ.
- Trưởng phòng Thạc sĩ – bác sĩ
Nguyễn Xuân Giao
* Chức năng
- Kiểm tra chất lương thuốc YHCT
- Nghiên cứu tế bào – tế bào gốc
-Nghiên cứu dược lý
* Hướng phát triển
- Nâng cao chất lượng kiểm tra thuốc
YHCT
- Nghiên cứu ứng dụng tế bào trong
điều trị và nghiên cứu thực nghiệm thuốc YHCT trên mô hình tế bào
- Xây dựng mô hình nghiên cứu dược lý
chuyên sâu.
CHƯƠNG II
CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM
1. Phương pháp cảm quan
- Phương pháp cảm quan nghĩa là dùng
các giác quan của chúng ta để đánh giá như nhìn bên nghoài về hình dáng, kích
thước, màu sắc, đối với một vài loài dược liệu thi cần phải bẻ ra để quan sát
bên trong. Mùi là đặc điểm của nhiều loại dược liệu chúa tinh dầu, nhựa. Vị có
thể ngọt như cam thảo, cỏ ngọt chua đối với dược liệu chứa acid hữu cơ, đắng
với các dược liệu chứa alkaloid, glycosid, cay như ớt, gừng …
Phân biệt bộ phận dùng: thân (Tô mộc,
Huyết giác …) vỏ thân (Hoàng bá, Đỗ trọng …) cành (Tang chi, Quế chi …) lá
(Tang diệp, Hà diệp …) hoa (Cúc hoa, Hồng hoa …) quả (Ngưu bang tử , Ké đầu
ngựa …)
Nhận xét cảm quan:
+ Màu sắc (vàng, xám, nâu…)
+ Mùi (thơm, hắc…)
+ Thể chất (giòn, mềm, dẻo)
+ Quan sát bên ngoài: Vết nhăn dọc,
ngang…
2. Xác định tạp chất có trong dược liệu
-
Gồm tất cả các chất ngoài quy định của dược liệu như; đất đá, rơm rạ, các bộ
phận không sử dụng làm dược liệu (hoa, thân, lá,... là tạp chất)
Cân
phân tạp chất và tính kết quả theo công thức: a
X% = p x 100
X% = p x 100
Ghi chú:
a:
khối lượng tạp chất
p:
khối lượng dược chất ( mẫu thử )
|
3. Phương pháp xác định tỷ lệ vụn nát của dược liệu
- Cân một
lượng dược liệu nhất định (p gam) đã được loại tạp chất.
Ghi chú: Lượng dược liệu lấy thử (tuỳ theo bản chất của dược liệu) từ 100 đến
200g. Ðối với dược liệu mỏng manh thì phải nhẹ nhàng tránh làm nát vụn thêm.
Phần bụi và bột vụn không phân biệt được bằng mắt thường.
|
4. Bằng Phương pháp Kiểm nghiệm hàm lượng ẩm
- Độ ẩm là lượng nước chứa trong 100g
dược liệu. Dược liệu tươi thường chứa một lượng nước rất lớn: lá chứa khoảng
60-80% H O. Thân và cành chứa khoảng 40-50%. Không có dược liệu nào đạt độ khô
tuyệt đối .nhưng đối với mỗi dược liệu đều được qui định một độ ẩm an toàn. Để
bảo quản tốt dược liệu cần có độ ẩm bằng hoặc dưới độ ẩm an toàn.
- Xác định độ ẩm là công việc đầu
tiên phải làm khi tiến hành xác định chất lược của một dược liệu. Hàm lượng các
hoạt chất như tinh dầu, chất béo, alkaloid, glycoside… đều được qui định trên
trọng lượng khô tuyệt đối của dược liệu
- Các phương pháp xác định độ ẩm
a, phương pháp sấy
- Dược liệu là lá , rễ , thân cần
được chia nhỏ trước khi xác định độ ẩm . dược liệu là nụ hoa, hạt nhỏ có thể
tiến hành xác định trực tiếp mà không cần chia nhỏ
Tiến hành :
+ Sấy khô cốc rồi để nguội trong bình
hút ẩm. Sau đó đem cân được khối lượng m1
+ Cân chính xác một lượng dược liệu
khoảng 1,0000gam=m
+ Sấy trong tủ sấy t=105 độ C trong
5h (nếu có qui định riêng 70 – 80 độ C thường là 4h)
+ Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm
rổi đem cân được m2
Lưu ý: làm lại nhiều lần đến khi
chênh lệch trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0.5mg
Độ ẩm (X%) của dược liệu được tính
theo công thức :
X% = m1+m-m2 x 100%
m
b, Phương pháp cất với dung môi
- Phương pháp này có thể áp dụng để
xác định độ ẩm cho tất cả các dược liệu . nhưng thương áp dung với các dược
liệu có chứa tinh dầu đương vi nếu áp dụng phương pháp sấy sẽ bị phân hủy (
đương sẽ bị cháy , tinh dầu sẽ bi bay hơi ) dẫn đến sai số lớn
- Cách tiến hành :
+ Rửa sạch dụng cụ : bình cầu ống
hứng
+ Thêm 200 ml toluene vào bimh2 cầu
và 20ml nước cất trong khoang 3h ( đun sôi ) cho đến khi không còn nước rơi
xuống ống hứng
+ Tắt bếp để nguội rồi đọc thể tích
nước cất được ơ ống hứng (v1)
+ Cân chính xác khoảng 10g dược liệu
( mấu thử) cho vào bình cầu . có thể cho một ít đá bọt 9 không bi trào)
+ Đun sôi tiếp khoảng 3h cho điên khi
mực nước trong ống không tăng lên
+ Tắt bếp để nguội và đọc kết quả .
thể tích nước trong ống hứng là ( v2)
+ Độ ẩm ( x% ) của dược liệu được
tính theo công thức:
X% = v2-v1/m . 100(%)
5. Bằng Phương pháp soi tinh bột – kiểm nghiệm
dược liệu dùng kính hiển vi
a, Giới thiệu Phương pháp kiểm nghiệm dược liệu
dùng kính hiển vi
Khi kiểm
nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, một số đặc điểm có tính bất đẳng
hướng về mặt quang học trở nên dễ quan sát hơn dưới kính hiển vi. Việc sử dụng
kính hiển vi kết hợp với kỹ thuật chụp ảnh hiển vi sẽ tạo nên những tư liệu có
giá trị minh hoạ cao. Khi sử dụng kính hiển vi cho phép làm tăng khả năng phân
biệt những đặc điểm nhỏ như các tinh thể calci oxalat hình kim, calci oxalat
dạng cát, làm tăng thêm các dữ kiện khi kiểm nghiệm dược liệu chứa tinh bột.
Việc quan sát, phân biệt hình dạng tinh thể các chất khi tiến hành vi thăng hoa
cũng thuận lợi hơn.
Hình ảnh tham gia soi bột trên kính
hiển vi
b, Các bước tiến hành
* Chuẩn bị dụng cụ
-
Chuẩn
bị kính hiển vi, phiến kính, lam kính, glycerin hoặc nước cất, giấy thấm, bột
dược liệu cần soi.
Bình đựng bột mẫu kiểm nghiệm
- Chuẩn bị tiêu bản bột
- Nhỏ lên đó 2-3 giọt glycerin 85%
lên giữa phiến kính
- Lấy ít tinh bột cần kiểm nghiệm
bằng kim mũi mác cho vào giọt glycerin trên kính
- Nghiền các hạt tinh bột bằng kim
mũi mác cho tới đều trong nước glycerin
- Đậy lam kính lên trên giọt bột cần
soi sao cho các hạt tinh bột tản đều và không đọng bọt khí
- Thấm nước thừa trên kính bằng giấy
thấm
- Đặt tiêu bản lên trên mâm kính cố
định bằng 2 cặp kính
- Soi bằng kính vật có độ phóng đại
từ nhỏ đến lớn (chú ý: Vật kính thường để ở 10x hay 40x , điều chỉnh vị trí của
vật kính cho chuẩn với tâm kính)
- So sánh và phân biệt các loại tinh
bột với nhau.
- Rửa sạch dụng cụ và vệ sinh nơi
thực hành.
* Quan sát trên kính hiển vi
- Với các vật thể là thân gỗ: Quan
sát các mô mềm, cứng, tinh bột, tinh thể oxalate
- Với các vật thể là hoa: Quan sát
phấn hoa, mảnh cánh hoa …
- Với vật thể là lá: Quan sát phiến
lá , mảnh mạch …
* Trong buổi thực tập làm thí nghiệm kiểm nghiệm dược liệu soi tinh
bột bằng phương pháp dùng kính hiển vi ,
nhóm 5 đã thực hiên trên các mẫu Cam thảo Bắc, Bạch thựơc , Phục linh………qua đó
các thành viên trong nhóm thay nhau quan sát để đưa ra những kết quả quan sát
của mình.
c, Kết quả
* Soi bột Cam thảo Bắc (Cam thảo ( rễ)
radix glyaprrhzae)
Các hình ảnh thu được khi soi bột Cam
thảo dưới kính hiển vi
1. Mảnh mô mềm chứa tinh bột
2. Mảnh bán cầu tạo từ những tế bào
hình đa giác
3. Mảnh mạch vạch, điểm
4. 5. Bó sợi mang tinh thể calci
oxalate hình khối kích thước khoảng 0,02 đến 0,035 mm
6. Hạt tinh bột hình tròn hoặc hình
trứng kích thước khoảng 0,005 đến 0, 015 mm
+ Nhận xét: Bột màu vàng nhạt đến vàng nâu. Soi kính hiển vi thấy các
mảnh mô mềm với các tế bào có thành mỏng chứa nhiều hạt tinh bột. Hạt tinh bột
đứng riêng rẽ, hình trứng hay hình cầu, có đường kính 2:20um. Sợi gỗ mầu vàng
có thành dầy thường kèm theo tế bào có tinh thể calcioxalat hình lăng trụ. Mảnh
mạch điểm màu vàng, mảng bầm mầu nâu đỏ.
* Soi Bột Phục
Linh phục linh ( poria )
Các hình ảnh thu được khi soi bột Phục Linh dưới kính
hiển vi
1. 2. Sợi nấm;
3. 4. Sợi nấm hình khối
+ Nhận xét: Bột màu trắng tro, có
những khối sợi dạng hạt không đều và những khối phân nhánh, không màu, nhỏ dung
dịch cloral hudrat sẽ tan dần. Soi kính hiển vi thấy sợi nấm không màu hoặc màu
nâu nhạt, mảnh dẻ, nhỏ, dài hơi cong, phân nhánh, đường kính 3:8um
* Soi Bột Bạch Thược ( rễ ) : radix paeoniae lactiplorae
Các hình ảnh thu được khi soi bột Bạch thựơc dưới kính hiển vi
1.
Các khối tinh bột bị hồ hóa
2. Mảnh mạch
3. Tinh thể calci oxalate
+ Nhận xét: Bột màu trắng, soi kính hiển
vi thấy các khối tinh bột bị hồ hóa. Tinh thể của calci oxalate đường kính
11:35um xếp thành hang hay rải rác trong tế bào mô mềm, mạch mang có đường kình
20:65um. Sợi gỗ dà , đường kính 15:40um thành dày hơi hóa gỗ.
KẾT LUẬN: Những kết quả trên cho thấy, trong kiểm nghiệm dược
liệu trên kính hiển vi là một phương tiện quan sát có hiệu quả. Các tư liệu về
hình dạng tinh thể của những chất vi thăng hoa được, những đặc điểm vi phẫu,
bột có tính đặc trưng dưới kính hiển vi, khi kết hợp với các phương pháp kiểm
nghiệm khác tạo nên hệ thống các tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu và các chế
phẩm có nguồn gốc dược liệu, nhằm tăng cường hiệu quả của việc quản lý chất
lượng thuốc Ðông dược, phục vụ tốt sự nghiệp bảo vệ sức khoẻ nhân dân.
6. Bằng phương pháp định tính
* Giới thiệu:
- Định tính được các hạt tinh bột,
định tính được acid hữu cơ trong dược liệu, chiết xuất và định tính được đường
trong dược liệu và nhận thức bằng cảm quan các vị thuốc.
* Chuẩn bị dụng cụ
- Chuẩn bị khay sứ trắng có lỗ, kim
mũi mác, dung dịch iod 1%, tinh bột cần thử.
- Chuẩn bị ống nghiệm 5ml, dung dịch
natri hydrocarbonat, quả chanh.
- Chuẩn bị dao (kéo), ống nghiệm 5ml,
10ml, đèn cồn, ống nhỏ giọt, thuốc thử Fehling A, Fehling B, dung dịch AgNO3/
NH4OH, nước cất…vv
- Chuẩn bị mẫu dược liệu kiểm nghiệm
Tiến hành Định tính:
* Bột Câu đằng ( ramulus cum
unco-uncariae )
- Đoạn thân hoặc cành có gai hình móc
câu đã phơi hay sấy khô của cây câu đằng (ncaria Sp) họ cà phê.
- Mô tả: Thân vuông, màu nâu thẫm,
được cắt đoạn 2:3cm đường kính 2:5mm, một đầu thường cắt sát gồm móc câu (ở
phía trên). Phần lớn mấu thân có 2 móc câu cong xuống hướng vào trong, đối diện
nhau, một số mấu chỉ có một móc câu ờ một bên và phía dưới đối diện là một sẹo
ở cao hơn. Các móc câu thường tròn hoặc hơi dẹt, đầu móc nhọn để tương tương
đối rộng. Chất cứng, dai, ruột màu trắng vàng hoặc có lỗ, không mùi vị nhạt.
Chuẩn bị mẫu dực liệu tiến hành định
tính
- Bột màu nâu
- Soi kính hiển vi thấy: lông che chở
đa bào 5 đến 7 tế bào, đầu tế bào thuôn nhọn, thành dầy, trên bề mặt chứa chất
màu nâu. Sợi tụ lại thành từng đám, thành dày.
Nhiều đám mô cứng có khoang rộng, ống trao đỗi rõ. Tinh thể calci oxalat
hình cầu gai mảnh mạch vạch, mạch xoắn.
+ Định tính:
-
Lấy
0,5g bột dược liệu, thấm ẩm bằng ammoniac, để yên 30p.
-
Cho
thêm 30ml Ethyl axetat lắc 5 đến10p rồi để yên 1h.
-
Gom
lọc dịch chiết vào bình gom chứa sẵn 5ml dung dịch H2SO4 5% lắc đều và tách lấy
lớp acid.
-
Gộp
các dịch acid cho vào các ống nghiệm
Ống 1 : thêm 2 giọt thuốc thử Dragendoff xuất hiện tủa đỏ cam
Ống 2 : thêm 2 giọt thuốc thử Bouchardat xuất hiện tủa nâu
Ống 3 : thêm 2 giọt dung dịch Acid piric xuất hiện tủa vàng
Ống 4 : thêm 2 giọt thuốc thử Mayer xuất hiện tủa vàng nhạt
* Bột Hòe hoa
(nụ hoa) (flos styphnolobii japonica imaturi )
- Nụ hoa đã phơi
hay sấy nhẹ đến khô của cây hòe ( styphnolobium japonicum(L.)schott.
- Họ đậu
fabacae, nụ hòe hình trứng có cuống nhỏ, ngắn, một đầu hơi nhọn, dài 3:6mm rộng
1:2mm màu vàng sám dài bằng ½ : 2/3 chiều dài của nụ hoa, phía trên xẻ thành 5
răng nông.
- Hoa chưa nở
dài từ 4:10mm đường kính 2:4mm cánh hoa chưa nở màu vàng.
- Mùi thơm vị
hơi đắng
- Bột : có nhiều
hạt phấn hình cầu, đường kính 10mm có 3 lỗ rãnh, bề mặt có nếp nhăn dạng mắt
lưới, lông che chở đa bào gồm 2:4 tế bào, tế bào ở phía đầu dài và thân nhọn,
tế bào ở chân thân ngắn.
- Mảnh biểu bì
cánh hoa gồm những tế bào hình nhiều cạnh, có nhiều vân nhỏ sát nhau
+ Định tính:
- Lấy 0,5g bột
dược liệu , thân 10ml ethanol.Đnn sôi trong 3 phút , đễ nguội lọc -dịch lọc A
- Tiếp đến lấy
2ml dung dịch A pha loãng với 10ml ethanol 90% chi vào 3 ống nghiệm
Ống 1 : thêm 5 giọt Acid hydrochloric và ít bột Maynesi dung dịch chuyển dần từ mày
vàng nhạt sang màu hồng rồi tím đỏ
Ống 2 : thêm 2 giọt dung dịch NaOH 20%, xuất hiện tủa vàng cam, tủa
sẽ tan trong lượng dư thuốc thử
Ống 3 : thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% dung dịch xuất hiện màu xanh
rêu
* Bột Viễn chí (rễ) (radix polygalae)
- Rễ phơi khô hay sấy khô của cây
Viễn chí lá nhỏ ( polygala-tennifolia wild ) và cây viễn chí xiberi tức viễn
chí lá trứng ( polygalei sibiria L.).
- Họ viễn chí (polyglaceae )
- Bột màu nâu nhạt, soi dưới kính
hiển vi thấy: mảnh bần mầu vàng nâu nhật, nhiều mảnh mô mềm tế bào dài hoặc hơi
tròn chứa nhiều giọt dầu.
- Có những giọt dầu đứng riêng lẻ,
nếu bỏ hết lõi thì không thấy mảnh mạch ở bột
+ Định tính:
-
Lấy
0.5g bột dược liệu thêm 2ml anhydric acetic lắc mạnh, để lắng 2 phút, lọc lần
l.
-
Lấy
dịch lọc thêm 1ml acid H2SO4 để có 2 lớp dung dịch phân tích rõ, phần tiếp giáp
giữa 2 dung dịch này sẽ xuất hiện màu nâu đỏ rồi chuyển dần sang màu lục đen
7. Phương pháp Sắc ký lớp mỏng
* Giới thiệu
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách
các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt
hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng
yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các
phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành
phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá
trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di
chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả,
ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng.
+ Dụng cụ
- Bình triển khai, thường bằng thuỷ
tinh trong suốt có kích thước phù hợp với các phiến kính cần dùng và có nắp đậy
kín.
- Dụng cụ để phun thuốc thử.
- Tủ sấy, máy sấy dùng để sấy khô sắc
ký đồ
- Ống mao quản hoặc dụng cụ thích
hợp.
- Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ có
chất phát quang thích hợp.
+ Chấm chất phân tích lên bản mỏng
(Chú ý: Khi làm sắc ký lớp mỏng bán định lượng, độ chính xác của kết quả
phân tích phụ thuộc rất nhiều vào độ chính xác của lượng chất thử đưa lên bản
mỏng, tức là thể tích dung dịch chấm lên bản mỏng. Do đó, với những trường hợp
phân tích bán định lượng phải dùng các mao quản định mức chính xác.)
+ Triển khai sắc ký:
- Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với
bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển.
- Ðể yên ở nhiệt độ không đổi.
- Khi dung môi đã triển khai trên bản
mỏng được một đoạn theo quy định, lấy bản mỏng ra khỏi bình, làm bay hơi dung
môi còn đọng lại trên bản mỏng.
-
Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr và tiến hành định
tính, phát hiện tạp chất hoặc định lượng như quy định trong chuyên luận riêng.
- Việc sắc ký lớp mỏng được tiến hành
trong điều kiện chuẩn hoá cho kết quả có độ tin cậy cao hơn. Hiện nay
người ta thường tiến hành sắc ký với sự giúp đỡ của hệ thống sắc ký lớp mỏng
hiệu năng cao
V. Kết luận.
Trên đây là
bản báo cáo tóm tắt quá trình học tập của em trong một tháng vừa qua tại khoa Đông
y thực nghiệm Bệnh viện y học cổ truyền Trung Ương. Nếu có gì thiếu sót
rất mong nhận được sự góp ý, phê bình… của thầy, cô giáo để em hoàn thiện hơn
trong quá trình học tập tiếp theo, cũng như thời gian làm việc sau này.
Em xin chân thành
cảm ơn!
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét